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Dr. Claudia Bechteler: Versuche zur Immunisierung von Garnelen (Penaeus monodon) gegen Vibrioneninfektionen


3.2.3 Entwicklung eines Vibrioseimpfstoffes für Garnelen (P. monodon)

Die Entwicklung des Vibrioseimpfstoffes für Garnelen auf der Basis des IBT-Verfahrens erfolgte in drei Schritten: Zunächst wurden eine größere Zahl lokalspezifischer Bakterienstämme auf ihre Eignung als Antigenlieferanten untersucht, anschließend mehrere Vibrio spp. ausgewählt und mit diesen dann verschiedene Impfstoffchargen hergestellt.

3.2.3.1 Untersuchung lokalspezifischer Bakterienstämme

Aus der Literatur geht hervor, daß die Erreger der Vibriose verhältnismäßig standortspezifisch sind. Sie kommen regional in unterschiedlichen Spezies und -stämmen vor, die zudem in ihrer Virulenz variieren. Voraussetzungen für die Entwicklung eines wirksamen Vibrioseimpfstoffes sind deshalb die Identifizierung der standorttypischen Erregerspezies und die Isolierung besonders virulenter Stämme als Antigenlieferanten.

Im April 1994 wurden 20 Bakterienstämme aus dem Süden Thailands an das IBT nach Göttingen gebracht. Diese waren bereits in Thailand der Gattung Vibrio zugeordnet worden. Am IBT erhielten sie die fortlaufenden Registriernummern 9471 bis 9490. Die Feldstämme 9479 bis 9490 stammen aus der Gegend um Songkhla, die übrigen Stämme aus benachbarten Regionen.

In die vergleichenden Untersuchungen wurden fünf Referenzstämme aus der Stammsammlung ATCC („American Type Culture Collection", USA) einbezogen, die als Haupt-erreger der Vibriose von Garnelen gelten. Sie wurden ebenfalls am IBT numeriert: 2032 (V. vulnificus), 2033 (V. parahaemolyticus I), 2034 (V. parahaemolyticus II), 2035 (V. alginolyticus) und 2036 (V. anguillarum).

Anhand verschiedener morphologischer Eigenschaften, Wachstumsverhalten, Verwertung organischer Kohlenstoffverbindungen und Hämolysinbildung wurden die Feldstämme bis zum Speziesniveau identifiziert und auf ihre Eignung zur Impfstoffproduktion überprüft. Herstellungsverfahren und Zusammensetzung der in den einzelnen Untersuchungen verwendeten Medien sind im Anhang aufgeführt.

3.2.3.1.1 Kultivierung und Aufbewahrung

Um die Feld- und Referenzstämme anzuzüchten, wurde jeder Stamm in 2 ml modifizierter „Brain Heart Infusion" (BHI) suspendiert, auf zwei Schraubdeckelröhrchen mit je 5 ml modifizierter BHI verteilt und durch wiederholtes Überimpfen bei 27 °C für 24 Stunden unter aeroben Verhältnissen vermehrt. Nachdem die Bakterienstämme ausreichend gewachsen waren, wurden sie in die Stammsammlung des IBT aufgenommen, wo sie bei -30 °C bis zum weiteren Gebrauch eingefroren wurden.

Zu Beginn der Versuchsreihen wurden die Bakterienkulturen der Stammsammlung entnommen, unter den obengenannten Bedingungen in modifizierter BHI, „Marine Broth" (MB) und auf MA inkubiert und immer wieder überimpft, um ständig frisches Material für die verschiedenen Untersuchungen zur Verfügung zu haben.

Sämtliche Bakterienkulturen wurden regelmäßig auf Kontaminationen überprüft. Zu diesem Zweck wurden vor dem Einfrieren Verdünnungsausstriche auf DST(„Diagnostic-Sensitivity-Test")-Agar, während der Versuchsreihen auf MA angefertigt. Die Platten wurden aerob bei 27 und 37 °C sowie anaerob bei 27 °C inkubiert. Nach 12 bis 18 Stunden wurden die Einzelkolonien begutachtet. Sowohl von verdächtigen als auch von unverdächtigen Kolonien wurden Objektträgerausstriche angefertigt und als Nativpräparat sowie nach Gram gefärbt unter dem Lichtmikroskop betrachtet.

Alle Feld- und Referenzstämme vermehrten sich unter aeroben, zum Teil auch unter anaeroben Inkubationsbedingungen bei 27 und 37 °C, wobei das Wachstum unter aeroben Bedingungen bei 27 °C am besten, unter anaeroben Bedingungen bei gleicher Temperatur während der kurzen Inkubationszeit von 12 bis 18 Stunden nur sehr gering war. Die untersuchten Bakterienstämme stellten sich unter dem Lichtmikroskop als überwiegend kurze, schlanke oder plumpe Stäbchen dar. Fadenformen wurden unter optimalen Inkubationsbedingungen (aerob/27 °C) gelegentlich beobachtet. Unter suboptimalen Inkubationsbedingungen und bei älteren Kulturen bildeten sich dagegen häufig Fadenformen aus. Fast alle Bakterienstämme waren gramnegativ, lediglich ein Feldstamm (9488) war grampositiv. Da es sich bei diesem nicht um eine Vibrio sp. handeln konnte, wurde er in den folgenden Untersuchungen nicht mehr berücksichtigt.

 

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Stand der letzten Aktualisierung: 21. November 2005
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