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Dr. Claudia Bechteler: Versuche zur Immunisierung von Garnelen (Penaeus monodon) gegen Vibrioneninfektionen


3.2.3.1.3 Hämolysine

Manche pathogenen Bakterien bilden bestimmte Toxine, sogenannte Hämolysine, die Hämoglobin abbauen und Erythrozyten zerstören. Diesen Vorgang nennt man Hämolyse. Die Fähigkeit zur Hämolysinbildung und die Stärke der Hämolyse kann als Maß für die Virulenz eines Krankheitserregers herangezogen werden. In den folgenden Versuchsreihen wurden Hämolysinbildung und Hämolysestärke der Feldstämme an Humanerythrozyten (HuE) untersucht.

Im qualitativen Hämolysetest wurde geprüft, ob die Feldstämme Hämolysine bilden und welcher Art die Hämolysereaktion ist. Zu diesem Zweck wurden Blutagarplatten (MA und HuE) mit je 10 l der Bakterienkulturen in 2 Parallelen beimpft und aerob bei 30 C 24 Stunden inkubiert. Eine Hämolysinbildung ist an dem die Bakterienkolonien umgebenden klaren Hof zu erkennen. Färbung und Größe des Hofs zeigen die Art der Hämolysereaktion an: Grünliche, schmale Höfe um die Kolonien entstehen durch Abbau des Hämoglobins bis zur Stufe des Methämoglobins im Inneren der ansonsten intakten Erythrozyten (-Hämolyse). Bei einer -Hämolyse wird das Hämoglobin noch weiter abgebaut und zusätzlich die Erythrozytenwände geschädigt. Das Hämoglobin tritt aus und diffundiert in das Medium. Es entstehen mehr oder weniger große, durchsichtige Höfe um die Kolonien. Keine sichtbare Wirkung auf die Erythrozyten des Blutagars wird als -Hämolyse bezeichnet.

Im quantitativen Hämolysetest wurde die Stärke der Hämolyse untersucht. Die Feldstämme wurden auf bzw. in unterschiedlichen Medien und unter verschiedenen Inkubationsbedingungen angezüchtet:

  • Beimpfung von Blutagar (MA und HuE) mit je 10 l der Bakterienkulturen in 2 Parallelen und aerobe Inkubation bei 30 C für 24 Stunden,
  • Beimpfung von Blutagar (MA und HuE) mit je 10 l der Bakterienkulturen in 2 Parallelen und anaerobe Inkubation bei 37 C für 18 Stunden,
  • Beimpfung von Flüssigmedium (MB), dem HuE zugesetzt worden waren, mit je 10 l der Bakterienkulturen in 2 Parallelen und aerobe Inkubation bei 30 C für 24 Stunden.

Die Hämolysestärke wurde wie folgt beurteilt: - = keine Hämolyse, +/- = schwache Hämolyse, + = Hämolyse, ++ = starke Hämolyse, +++ = sehr starke Hämolyse.

In Anlehnung an Gessler (1994) wurde ein weiterer quantitativer Hämolysetest in Mikrotiterplatten durchgeführt. Die Vorgehensweise war leicht modifiziert. Dies betraf die Toxingewinnung (Abzentrifugation des Kulturüberstandes nach Anzüchtung in MB über 24 Stunden), die getesteten Erythrozyten (HuE), die Inkubationszeit bei 37 C (1,5 Stunden) und die Umdrehungszahl (3.000 g, 10 Minuten). Die Hämolysestärke wurde nach der Anzahl Verdünnungsstufen, bis zu der die Hämolyse mit dem bloßen Auge noch erkennbar war, bewertet. Je höher die Zahl der Verdünnungsstufen ist, bis zu der eine Hämolyse sichtbar ist, desto stärker ist die Hämolyse. Keine Hämolyse wurde mit einem -" gekennzeichnet.

Die Ergebnisse des qualitativen und der quantitativen Hämolysetests in Abhängigkeit von Medium und Inkubationsbedingungen sind in Abb. 8 wiedergegeben. Aus der Tabelle geht außerdem die Zuordnung der Feldstämme zu den Vibrio spp. hervor (Kapitel 3.2.3.1.2 Morphologie, Wachstumsverhalten und Verwertung organischer Kohlenstoffverbindungen). Auf MA mit HuE und aerober Inkubation bei 30 C für 24 Stunden zeigten fast alle Stämme eine deutliche -Hämolyse (1, 2). Lediglich die Stämme 9485, 9486, 9489 und 9490 bildeten unter diesen Bedingungen keine Hämolysine. Das ändert sich, wenn entweder die Inkubationsbedingungen (3) oder das Medium (4) variiert werden. Beim V. vulnificus-Stamm 9480 und dem V. alginolyticus-Stamm 9482 konnte unter allen Anzuchtbedingungen eine mehr oder weniger starke Hämolyse beobachtet werden. Vergleicht man die V. parahaemolyticus-Stämme miteinander, weist der Stamm 9481 insgesamt die stärkste Hämolyse auf.

 

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Stand der letzten Aktualisierung: 21. November 2005
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