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Dr. Claudia Bechteler: Versuche zur Immunisierung von Garnelen (Penaeus monodon) gegen Vibrioneninfektionen


3.2.3.2 Auswahl geeigneter Vibrio spp. für die Impfstoffproduktion

Nach dem Ergebnis der Literaturauswertung ist nicht zu erwarten, daß sich die unter Laborbedingungen geprüften monovalenten Vibrioseimpfstoffe in der Praxis der Garnelen-zucht bewähren. Benötigt wird vielmehr ein polyvalenter Impfstoff, da die Vibriose durch eine ganze Reihe von Erregern der Gattung Vibrio hervorgerufen wird und es der Literatur zufolge keine oder nur eine sehr gering ausgeprägte Kreuzreaktion zwischen den verschiedenen Spezies gibt. Aus den 20 untersuchten Feldstämmen Südthailands sollten deshalb mehrere Vibrio spp. ausgewählt werden. Ihre Eignung zur Impfstoffproduktion wurde nach folgendem Raster geprüft:

  • Zugehörigkeit zur Gattung Vibrio,
  • ausreichend sichere Identifizierung bis zum Speziesniveau,
  • deutliche Hämolyse.

Drei Stämme erfüllten alle Kriterien, und zwar 9480 (V. vulnificus), 9481 (V. parahaemolyticus) und 9482 (V. alginolyticus). Nach dem quantitativen Hämolysetest weisen sie eine hohe Virulenz auf. Sie wurden daher als Antigenlieferanten zur Herstellung mehrerer Impfstoffchargen herangezogen.

3.2.3.3 Produktion mehrerer Impfstoffchargen mit dem Göttinger Bioreaktor

Bevor mit der eigentlichen Impfstoffproduktion begonnen werden konnte, mußten ein geeignetes Anzuchtmedium gefunden und die Betriebsparameter des Göttinger Bioreaktors pH-Wert und Temperatur optimiert werden. Das Anzuchtmedium sollte ein hohes Bakterienwachstum gewährleisten und in Mineralstoffgehalt und -zusammensetzung dem natürlichen Habitat der Vibrio spp. entsprechen. Unter diesen Bedingungen bilden sie die erforderlichen Toxine. Für die Funktionsfähigkeit des Bioreaktors mußten die Mineralstoffsalze im Medium vollständig gelöst sein. Mit diesen Vorgaben wurden verschiedene Flüssigmedien hergestellt, mit den Feldstämmen beimpft und unter Standardbedingungen (aerob, 27 C, 24 h) inkubiert. Zu den besten Ergebnissen führte MB mit Pepton- und Glukosezusatz.

Die modifizierte MB wurde anschließend mit einem der drei für die Impfstoffproduktion vorgesehenen Vibrio spp. inokuliert und im Göttinger Bioreaktor (88, 258, 276) bebrütet.

Unter Beachtung des Redoxpotentials und mit abgestimmter Mediumzufuhr wurden der pH-Wert - über Säure- bzw. Laugezugabe - und die Temperatur solange variiert, bis sich ein maximales Bakterienwachstum bei guter Qualität ergab. Wachstum und Qualität der Bakterienkultur wurden durch laufende Probennahme auf Zelldichte, Zellmasse, Bakterienaktivität, Homogenität, Reinheit und Hämolysestärke untersucht.

Die Zelldichte wurde optisch erfaßt. Zu diesem Zweck wurden 100 l PBS (Phosphate Buffered Saline) in 4 Vertiefungen U-förmiger Mikrotiterplatten vorgelegt und je 100 l Fermenterprobe dazupipettiert. Die Messung der Absorption als Maß für die Zelldichte erfolgte unmittelbar im Anschluß im Mikrotiterplattenphotometer bei einer Wellenlänge von 540 nm gegen PBS als Nullwert (276). Die Zellmasse wurde mit Hilfe kalibrierter Zentrifugenröhrchen (Hopkinstuben) bestimmt. An der Spitze dieser Röhrchen befindet sich eine Skala von 0,01 bis 0,06 ml. Die mit 4,5 ml Aqua dest. und je 0,5 ml Fermenterprobe befüllten Röhrchen wurden 50 Minuten bei 2.500 g zentrifugiert und die Zellmasse als Volumen abgelesen (276). Bakterienaktivität, Homogenität, Reinheit und Hämolysestärke der Fermenterproben wurden mit den in den Kapiteln 3.2.3.1.1 (Kultivierung und Aufbewahrung) und 3.2.3.1.3 (Hämolysine) beschriebenen Verfahren bestimmt. Die auf diese Weise gefundenen optimalen Betriebsparameter lagen bei einem pH-Wert von 7,1 und einer Temperatur von 30 C.

Nun konnte auf der Basis des vom IBT entwickelten kontinuierlichen Fermenterverfahrens mit anschließender Ultrafiltration die eigentliche Impfstoffproduktion beginnen. Zunächst wurde der Bakterienstamm 9480 (V. vulnificus) im Göttinger Bioreaktor auf modifizierter MB vermehrt. Die Betriebsparameter pH-Wert und Temperatur wurden auf 7,1 bzw. 30 C eingestellt und während des Fermentationsprozesses konstant gehalten. Nach zwölf Stunden wurde die Kulturbrühe aus dem Fermenter abgezogen, zur Stabilisierung sofort mit 0,5 % Formalin versetzt und bis zur Inaktivierung vier Tage bei 37 C aufbewahrt. Der Formalingehalt wurde täglich kontrolliert und die Konzentration auf 0,5 % gehalten. Anschließend wurde das entstandene sterile Bacterin einer zweistufigen Kaskadenultrafiltration durch Hohlfaserfilter unterschiedlicher Porengröße unterzogen (33, 258). Dabei erfolgte die Trennung der inaktivierten Bakterien von den Toxoiden sowie die Abscheidung von Nährbodenbestandteilen und allergisierenden Stoffwechselprodukten der Bakterien. Gleichzeitig wurden die beiden Fraktionen durch Wasserentzug aufkonzentriert und der Formalingehalt reduziert. Nachdem auch die Stämme 9481 (V. parahaemolyticus) und 9482 (V. alginolyticus) diesen Prozeß durchlaufen hatten, entstanden so insgesamt je drei

Bakterienzell- und Toxoidfraktionen. Das beschriebene Verfahren wurde für jeden Vibrionenstamm dreimal durchgeführt, zum Teil in Rückkopplung mit Versuchen, die parallel in Thailand abliefen. Nach jedem Durchlauf der drei Stämme wurde aus den sechs Fraktio-nen eine Impfstoffcharge hergestellt, in Fläschchen abgefüllt und bis zum Gebrauch bei 4 C aufbewahrt:

  • Für die erste Impfstoffcharge (3 Impfstoffkomponenten) wurden die drei Bakterienzell- und die drei Toxoidfraktionen untereinander zu gleichen Teilen gemischt. Auf diese Weise erhielt man zwei Impfstoffkomponenten. Der Formalingehalt war bei der Ultrafiltration auf jeweils 0,2 % eingestellt worden. Die Bakterienzellkomponente wurde zusätzlich einer Ultraschallbehandlung unterzogen. Damit sollten durch eine Zertrümmerung der Zellwände etwa vorhandene antigenetisch relevante Plasmabestandteile freigesetzt werden. Eine dritte Impfstoffkomponente bestand aus reinem Formalin, sie wurde als Formaldehyd gesondert abgefüllt.
  • Für die zweite Impfstoffcharge (Penvax I) wurden alle Bakterien- und Toxoidfraktionen zu gleichen Teilen miteinander gemischt. Das so hergestellte trivalente Bacterin wurde ebenfalls mit Ultraschall behandelt. Der Formalingehalt betrug 0,02 %.
  • Die dritte Impfstoffcharge (Penvax II) unterschied sich von Penvax I durch die fehlende Ultraschallbehandlung.

Die Auszählung der koloniebildenden Einheiten (CFU) ergab einen Schätzwert von 1,2 x 1010 Bakterienzellen pro ml Konzentrat.

 

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Stand der letzten Aktualisierung: 21. November 2005
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